Kromatografi

Ilustrasi : studifarmasi.blogspot.com

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi differensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari 2 fase atau lebih, salah satu diantaranya, bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan diantaranya zat-zat itu menunjukan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion.

Tehnik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi diantara dua fase, satu diantaranya fase diam, yang lainnya fase bergerak. Fase bergerak zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya, yang tereluasi lebih awal atau lebih akhir.

Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam dapat bertindak sebagai zat seperti penyerap alumina yang diaktifkan, silikagel, dan resin penukar ion, atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga menjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Dalam proses terakhir ini suatu lapisan cairan pada suatu penyangga yang iner berfungsi sebagai fase diam. Partisi merupakan mekanisme pemisahan yang utama dalam kromatografi gas, cair, kertas, dan bentuk kromatografi kolom yang disebut kromatografi cair-cair. Dalam praktek, seringkali pemisahan disebabkan oleh suatu kombinasi efek adsorpsi dan partisi.

Jadi berdasarkan perbedaan fase diam dan fase geraknya, kromatografi dapat berupa kromatografi kolom, kromatografi gas, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi. Kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis umumnya lebih bermanfaat untuk tujuan identifikasi, karena mudah dan sederhana. Kromatografi kolom memberikan pilhan fase diam yang lebih luas dan berguna untuk pemisahan masing-masing senyawa secara kuantitatif. Kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi keduanya mebutuhkan peralatan yang lebih rumit dan umumnya merupakan metode dengan resolusi tinggi yang dapat mengidentifikasi serta menetapkan secara  kuantitatif bahan dalam jumlah yang sangat kecil.

Pengunaan baku pembanding dalam uji indentifikasi dalam kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis, perbandingan jarak rambat ( diukur sampai titik yang memberikan intensitas maksimum pada bercak ) suatu senyawa tertentu terhadap jarak rambat fase gerak, diukur dari titik penotolan, dinyatakan sebagai harga R, senyawa tersebut perbandingan jarak rambat suatu senyawa tertentu dengan jarak perambatan baku pembanding yang sama dengan uji pada kromatogram yang sama.

Untuk maksud ini kromatogram dibuat dengan menotolkan larutan uji, larutan baku pembanding, dan suatu campuran uji dan baku pembanding dalam jumlah yang kurang lebih sama pada penjerat lapis tipis atau kertas, dalam satu garis lurus sejajar dengan tepi lempeng kromatografi atau kertas. Tiap penotolan contoh mengandung zat uji yang bobotnya kurang lebih sama. Jika zat uji yang dindentifiksai dan baku pembanding itu sama, terdapat kesesuaian dalam warna dan harga R pada suatu kromatogram, dan kromatogram dari campuran mengahasilkan bercak tunggal, yaitu harga R adalah 1,0.

ASAS KROMATOGRAFI

            Tehnik pemisahan setiap komponen dalam campuran mempunyai interaksi yan berbeda terhadap linkungannya dibandingkan dengan komponen lain pada kondisi yang sama. Setiap komponen ditahan oleh suatu fase tetap berdasarkan pada perbedaan keseimbangan distribusi komponen antara 2 fase yaitu fase tetap dan fase gerak yang tidak saling bercampur. Pemisahan terjadi karena kecepatan migrasi sebagai hasil dari perbedaan dalam keseimbangan.

1.         KROMATOGRAFI  KOLOM

Kromatografi Kolom merupakan salah satu cara kromatografi yang sering digunakan. Peralatan yang digunakan untuk cara ini cukup sederhana. Terjadinya pemisahan dapat secara adsorpasi, partisi atau keduanya.

Macam-macam Kromatografi Kolom :

1.1       KROMATOGRAFI  KOLOM  ADSORPSI

Prinsip dari permisahan komponen-komponen adalah adsorpsi diantara permukaan padatan - cairan (solid liquid interface). Supaya didapatkan permisahan yang baik. senyawa-senyawa didalam campuran harus mempunyai afinitas yang berbeda terhadap Zat penyerap dan harus ada saling interaksi di antara zat penyerap dan komponen. Pada saat zat penyerap yang ditambah dengan contoh dialiri pelarut. komponen-komponen didalam campuran akan bergerak turun dengan kecepatan tertentu hingga tcrjadi pemisahan di dalam kolom yang disebut kromatogram. Kecepatan bergerak dari tiap komponen berbeda-beda dan di pengaruhi oleh partikel didaerah permukaan mutu dari zat. Kemampatan dari zat penyerap dan atografi. Berikut ini diberikan sebuah kromatografi kolom adsorpsi.

Dalam laboratorium sekolah, seringkali dengan mudah digunakan buret biasa sebagai kromatografi kolom.

lapisan dari bahan

pelarut pada bagian

atas kolom                                       Kolom bungkus dengan alumina atau agar-agar silica

        dengan sepenuhnya memenuhi dengan bahan pelarut

                      

                                                          Serat kaca untuk mencegah fase stasioner

          yang sedang menghilangkan noda kolom

Pemisahan dan campuran yang terdiri dari dalam kolom kromatografi adsorpsi sederhana

Pemisahan dapat pula dilakukan dengan cara kromatografi mengalir. Pada cara ini. pelarut melarutkan komponen yang akan dianalisis sehingga komponen tersebut keluar kedalam eluat. Jika dikehendaki. pemisahan beberapa komponen dapat dilakukan dengan mengalirkan pelarut yang sama lebih lanjut atau pelarut lain dengan daya elusi lebih kuat.

Berbagai zat penyerap dengan aktivitas yang berbeda-beda dapat ditemukan dan zat penyerap yang baik harus memenuhi persyaratan sebagai berikut : tidak larut dalam fase gerak, tidak bereaksi dengan contoh secara kimiawi. iner; cukup akif sehingga memungkinkan teradinya perambatan contoh ; sebaiknya tidak berwarna: memungkinkan terjadinya aliran yang baik bagi fase gerak: reprodusibel.                                            

Aktivitas dari zat penyerap dapat ditingkatkan dengan cara kimia atau fisika. misalnya dengan penambahan asam atau basa, pencucian dan pemanasan. Kadanng-kadang dilakukan dengan penambahan air misalnya pada alumina.

Absorpsi dari pelarut tidak polar seperti eter minyak tanah atau benzen dan pelarut tunggal kadang-kadang kurang efektif untuk mengembangkan kromatogram, Jarak turun komponen  pada kolom dapat ditingkatkan dengan penambahan pelarut yang lebih polar.

Penggantian dari suatu pelarut ke pelarut lain sebaiknya secara bertahap. Sebagai contoh. apabila eter minyak tanah di ganti dengan benzen, harus dilakukan sebagian-sebagian seperti berikut : mula-mula eter minyak tanah dibandingkan benzen 100 : 0: 95 : 5 : 90 : 10 : 80 : 20 : 60 : 40 : 40 : 6() : 10 : 90 : 100 benzen. Prosedur sepenti ini memerlukan waktu yang lama dan supaya elusi lebih cepat hendaknya ditambahkan lebih kurang 0.5 sampai 1.0% etanol kepada pelarut polar yang mula-mula digunakan.

Contoh-contoh zat penyerap dan fase gerak yang sering digunakan dapat dilihat pada tabel dibawah ini :

Lemah ZAT PENYERAP

FASE GERAK

Sukrosa Pati Inulin Talk Natrium Karbonat Kalsium Karbonat                                       d Kalsium Fosfat                                             a Magnesium Karbonat                                  y Magnesium Oksida                                      a Kalsium Hidroksida Magnesium silikat aktif                               a Alumina aktif                                               b Arang aktif                                                   s Magnesia aktif                                             o Kuat Tanah Fullers                                               p

Eter minyak tanah                  Karbon tetra klorida                  Sikloheksan                  Karbon disulfida d               Eter a              Aseton y              Benzen a              Ester                Ester e               Kloroform l               Alkohol u              Air s              Piridin i               Asam organik

           

1.2       KROMATOGRAFI KOLOM PARTISI

Pada kromatografi partisi, zat yang harus dipisahkan terbagi antara dua cairan yang tidak saling bercampur. Salah satu cairan, yaitu fase diam, umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat, karena itu mempunyai area permukaan yang sangat luas terhadap pelarut yang mengalir atau fase gerak. Kontak cairan dengan cairan secara berturutan yang berulang kali terjadi, menghasilkan efisiensi pemisahan yang tak dapat dicapai dengan cara ekstraksi cair-cair biasa.

Penyangga padat, umumnya bersifat polar dan fase diam yang teradsorpsi bersifat lebih polar dan pada fase gerak. Penyangga padat yang banyak digunakan adalah tanah silika untuk kromatografi, seperti Celite 545 yang dicuci dengan asam, dengan ukuran partikel yang sesuai sehingga fase gerak dapat mengalir dengan baik. Pada kromatografi partisi fase baik, fase diam yang teradsorpsi.bersifat kurang polar dari pada fase gerak dan zat penyerap padat dibuat nonpolar dengan perlakuan yang sesuai menggunakan pereaksi silanisasi, seperti diklorodimetilsilana, sehingga dihasilkan tanah silika yang tersilanisasi untuk kromatografi.

Contoh yang akan dikromatografi umumnya dimasukkan kedalam sistem kromatografi menggunakan salah satu dari dua cara berikut :

·         Larutan uji dalam sejumlah kecil fase gerak dimasukkan kedalam kolom

·         Larutan uji dalam sejumlah kecil fase diam dicampur dengan penyangga padat dan dimasukkan kedalam kolom sebagai lapisan diatas campuran fase diam dan zat penyerap.                  

Pada kromatografi partisi cair-cair yang konvensional, derajat partisi suatu senyawa tertentu diantara dua fase cair dinyatakan sebagai koefisien partisi atau koefisien distribusi. Dalam hal ini senyawa yang terdisosiasi, distribusi dapat diatur dengan jalan modifikasi pH, tetapan dielektrik, kekuatan ion serta sifat-sifat lain dari ke dua fase tersebut. Eluasi selektif komponen-komponen suatu campuran dapat dicapai dengan mengubah fase gerak sampai diperoleh koefisien partisi yang lebih baik atau dengan jalan mengubah pH fase diam secara in situ dengan suatu fase gerak, yang terdiri dari larutan asam atau basa yang sesuai dalam pelarut organik.

Pada kromatografi partisi dapat digunakan bahan-bahan sebagai berikut :

*   Bahan Penyangga

     Beberapa zat padat, misalnya tanah silika murni

*   Fase Diam

Dapat digunakan pelarut atau larutan yang tercantum pada monografi masing-masing. Bila yang digunakan sebagai fase diam merupakan campuran, hendaknya dicampur dulu sebelum disalut pada bahan penyangga.

*   Fase Gerak

Dapat digunakan pelarut yang sesuai dengan yang tercantum pada monografinya. Bila fase diam dapat campur dengan air, hendaknya diseimbangkan dengan air terlebih dahulu, bila fase diam adalah senyawa organik polar, hendaknya di seimbangi dengan pelarutnya terlebih dahulu.        

1.3       CARA PENYIAPAN KOLOM

            Kolom kromatografi pada umumnya dibuat di laboratorium zat ini dapat diperoleh kolom kromatonnya (Merck) atau Se-pakaian kolom kromatografi pada umumnya berikut :

                                                                                    Cadangan fase gerak

                                                                                   

                                                                                   

                                                                  Fase Gerak

                                                                  Kertas saring atau bahan penyaring   

                                                     

Bahan penyaring bila perlu

Sumbatan kapas atau serabut gelas

                                                                  Labu Penampung

a)      Pemilihan Kolom

Pada pemilihan ukuran kolom harus diperhitungkan jumlah contoh. Sebagai pedoman dapat digunakan patokan sebagai berikut :

*   Perbandingan bobot zat penyerap dan contoh (30 = 1)

*   Perbandingan panjang kolom dengan diameter (10 – 15)

*   Untuk   contoh   multi  komponen  dan  contoh  yang  komponen - komponennya

      mempunyai   afinitas   yang   sama   terhadap   zat   penyerap  digunakan  kolom

      panjang.

*   Untuk  contoh  yang   komponen - komponenya   mempunyai   afinitas   berbeda

      terhadap zat penyerap digunakan kolom pendek

           

b)      Cara memasukkan zat penyerap kedalam kolom

*   Metode kering

      Zat penyerap dimasukkan secara langsung kedalam kolom kromatografi. Penambahan secara sedikit demi sedikit dengan hati-hati sambil kolom diketuk-ketuk. Pelarut/fase gerak dituang sedikit demi sedikit dan tutup kolom dibuka sampai cairan menetes. Kran ditutup kembali apabila permukaan cairan kira-kira 1 cm diatas permukaan penyerap.

*    Metode bubur

      Bahan penyerap dicampur dengan pelarut di dalam sebuah gelas piala, kemudian dituang kedalam kolom yang telah diisi dengan pelarut setinggi 2/3 dari kolom. Dasar kolom sudah disumbat dengan serabut gelas atau kapas dan bila perlu ditambah bahan penyaring guna mencegah pengadukan terhadap zat penyerap sewaktu berlangsung penambahan pelarut. Tinggi pelarut tidak mencegah terjadinya retakan pada lapisan zat penyerap yang mungkin menyebabkan gangguan terhadap elusi

*    Metode basah

      Zat penyerap dituang langsung kedalam kolom yang telah diberi pelarut sambil kolom diketuk-ketuk untuk menghilangkan gelembung udara.

1.4       CARA PENGGUNAAAN KOLOM

Contoh memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau, buat larutan jenuh dari campuran dengan menggunakan pelarut yang lebih disukai dalam kolom.                        

Pertama membuka kran penutup untuk membiarkan pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas, dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga campuran berwarna akan diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar dibawah ini:

Campuran Hijau

                   

Selanjutnya tambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, cegah sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut mengalir kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering.
Gambar berikut menunjukkan perubahan yang mungkin terjadi sejalan dengan perubahan waktu

Menambahkan bahan pelarut baru

                   

Senyawa biru lebih polar daripada senyawa kuning dan memungkinkan mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen. Anda dapat mengatakan ini karena senyawa biru tidak bergerak secara sangat cepat melalui kolom. Itu berarti bahwa senyawa biru harus dijerap secara kuat pada jel silika atau alumina dibanding dengan senyawa kuning. Karena kurang polar, senyawa kuning menghabiskan waktu dalam pelarut, sehingga keluar dari kolom lebih cepat.

Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal sebagai elusi, sedangkan pelarut disebut sebagai eluen.

1.5       HAL – HAL  YANG PERLU DIPERHATIKAN

a)                  Pemilihan sistem kromatografi

Pemilihan dapat didasarkan pustaka yang ada, atau penggunaan data dari kromatografi pendahuluan dengan kromatografi kertas atau lapis tipis                             

b)                  Cara penyiapan kolom

Pemilihan kolom dan cara-cara penyiapannya harus benar supaya diperoleh kolom yang baik dan serba sama yang dapat menjamin terjadinya elusi yang baik

c)                  Penambahan contoh kedalam kolom

           Contoh yang telah disiapkan dengan benar baru ditambahkan secara kuantitatif kedalam kolom.

d)                 Pengembangan kromatogram dengan cara melakukan perkolasi larutan

Elusi harus dilakukan dengan benar, tidak terlalu cepat atau lambat dan harus dijaga supaya permukaan larutan (fase gerak) selalu diatas permukaan zat penyerap supaya diperoleh kromatogram yang baik.

e)                  Recovery dari fraksi

Pemilihan sistem kromatografi yang tepat dan cara-cara kromatografi yang benar akan menghasilkan recovery yang baik

2.         KROMATOGRAFI KERTAS

            Kromatografi kertas adalah cara pemisahan suatu komponen zat didalam campuran dengan jalan penyarian menggunakan fase gerak zat cair dan fase diam yang berupa air/zat cair lainnya yang berada dalam serat-serat selulosa pada kertas.

Prinsip kerja :

            Suatu zat yang terdapat dalam campuran akan terpisah disebabkan adanya proses migrasi yang dinamis dalam suatu sistem yang terdiri dari 2 fase, dimana suatu fase bergerak terus menerus dengan arah tertentu dan masing-masing substansi menjalankan kecepatan yang disebabkan oleh perbedaan partisi, kelenturan, tekanan, uap dan ukuran molekul.

Berikut mengenai eksperimen klasik yang dirancang untuk memisahkan asam-asam amino. Sepotong kertas saring Whatman No. 1, sekitar 25-30 cm panjangnya dan 1.5 cm lebarnya, ditandai garis tipis dengan pensil sekitar 5 cm dan salah satu ujung campuran itu, yang mengandung masing-masing 5-15 mikrogram (mg) glisina, alanina, valina, dan leusina dalam 2-4 mikroliter (ml) larutan total diteteskan dari dalam sebuah pipet kapiler pada suatu titik A yang ditandai di tengah garis pensil (Lihat gambar I.a).

         

Gambar I

Pelarut dibiarkan menguap. Pengembangan disiapkan dengan mengocok campuran fenol cair dan air dengan kuantitas yang kira-kira sama, dalam sebuah corong pisah selama beberapa menit ; fase itu dibiarkan berpisah dengan tajam, dan lapisan air di atas diambil dan dimasukkan ke dalam pinggan, yang ditaruh di dasar suatu bejana gas besar (Gambar I.b - yang tidak digambar secara sebanding). Kertas itu digantung dalam bejana gas dengan ujung atasnya dicelupkan dalam palung kaca. Cairan dimasukkan untuk menjenuhi udara dalam bejana gas dengan air dan fenol, yang perbandingannya ada dalam kesetimbangan dengan pengembang; setelah beberapa saat kertas itu menjadi terkondisikan terhadap reagensia itu (pengkondisian kertas ini biasanya tidak perlu dalam kromatografi anorganik). Pengembang, yang adalah fase fenol di bawah, sekarang dimasukkan ke dalam palung kaca dan bejana gas itu ditutup. Pengembang bergerak oleh kerja kapiler ke dalam kertas, dan dibantu oleh gaya berat, bergerak ke bawah melewati campuran pada A itu, dan mulailah pengembangan. Fase bergerak yang meruah adalah fenol yang mengandung air, dan fase stasioner tipis adalah air (mengandung fenol) yang terserap pada kertas. Setelah garis depan pengembang bergerak hampir ke pinggir bawah kertas, bejana gas dibuka, kertas diambil, dan posisi depan B segera ditandai (Gambar I.c). Kertas itu kemudian dibiarkan mengering. Asam-asam amino tidak berwarna dan untuk menunjukkan posisi zona, digunakan reaksi warna ninhidrin. Kertas itu disemnprot dengan larutan 0,1 persen ninhidrin dalam butanol dan dihangatkan dalam waktu singkat untuk mempercepat reaksi dengan asam amino. Zona asam amino nampak sebagai noda merah-ungu (Gambar I.d). Kromatogram yang dihasilkan diuraikan dan zona-zona dicirikan oleh nilai-nilai RF. NiIai RF didefinisikan oleh hubungan :

RF  =

                      Jarak (cm) dari garis awal ke pusat zona (L1)

                  Jarak (cm) dari garis awal ke garis depan pelarut (Lf)

Harga RF mengukur kecepatan bergeraknya zona relatif terhadap garis depan pengembang. Pengukuran itu dilakukan dengan mengukur jarak dan titik pemberangkatan (pusat zona campuran awal) ke garis depan pengembang dan pusat rapatan tiap zona: jadi untuk zona 1, R L1/LF (Gambar I.d). Nilai RF akan menunjukkan identitas asain-asam amino, dan intensitas zone itu dapat digunakan scbagai ukuran konsentrasi dengan membandingkan dengan noda-noda standar.

2.1              HAL – HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN

a)   Jenis Kertas

      Kertas selulosa murni khusus dibuat untuk kromatografi maupun kertas yang sudah dimodifikasi contoh modifikasi dengan :

*   Zat kimia : kertas diasetilasi untuk pemisahan steroid

*   Kertas  yang  di  Impregnase :  kertas  di  impregnase  dengan minyak

     untuk pemisahan amina

*   Kertas yang diberi zat tambahan

b)   Pemilihan fase gerak

      Sebagai fase gerak biasanya berupa campuran pelarut yang bersifat netral, asam atau basa

           

c)   Penotolan contoh

      Untuk penotolan digunakan pipet mikro. Karena umumnya kadar larutan contoh 0.1 % – 1 % dan jumlah yang ditotolkan antara 1 – 10 ml.

d)   Phase Pengembangan

      Ada beberapa cara pengembangan :

            *   Pengembangan menurun

Bejana  kromatografi  dilengkapi  dengan  tempat  fase  bergerak yang    

tergantung dibagian atas ujung kertas  kromatografi  dicelupkan  pada

cairan  pengembang  yang   akan   melewati   tempat   penotolan   dan

mengalir kebawah.

                  

            *   Pengembang menaik

Kertas kromatografi yang telah ditotol contoh dicelupkan dalam cairan yang berbeda didasar bejana, cara ini lebih mudah karena sederhananya peralatan dan penjenuhan bejana dengan uap cairan lebih mudah dicapai.

                                    *   Pengembangan mendatar

Kertas pada posisi mendatar dan ujungnya dikaitkan pada suatu alat yang dekat dengan tempat penotolan dicelupkan cairan pengembang

                                    *   Pengembang melingkar

Kertas diletakkan mendatar, digunakan piring petri dilengkapi dengan sumbu senyawa yang di pisahkan akan membentuk noda yang melingkar.

                                   

                                    *   Pengembang dua dimensi

Senyawa yang akan dipisahkan ditotolkan pada ujung kertas kemudian dilakukan proses pengembangan dengan cairan pertama, setelah itu kertas diputar 90^O, dengan dilakukan proses pengembangan dengan cairan pengembang yang kedua.

           

                                    *   Pengembang bertingkat

Pengembang dengan menggunakan dua cairan pengembang yang komposisinya berbeda, misalnya pengembang pertama dengan menggunakan cairan yang polar sampai jarak tertentu, kemudian untuk senyawa yang tertinggal pada tempat penotolan digunakan cairan pengembang lain yang dapat membawa senyawa yang semula tetap terdapat pada titik penotolan.

                                    *   Overrun dan pengembangan ganda

Dilakukan proses pengembangan sampai mencapai batas pengembangan, kertas diambil kemudian dikeringkan di udara, kemudian dilakukan proses pengembangan kembali sampai cairan mencapai batas pengembangan. Dilakukan berkali-kali untuk memperoleh hasil pemisahan yang baik.

                        e)   Komponen

                                    *   Bejana kromatografi

                                    *   Fase diam (kertas kromatografi)

                                    *   Pipet Mikro/Kapiler

            2.2       DETEKSI (PENAMPAKAN BERCAK)

                       

                        a)   Cara Kimia

Bercak dapat dideteksi dengan menyemprot larutan pereaksi/enzim yang cocok dan biasanya sudah tertera pada monografinya. Alat penyemprot disebut Atomizer atau spaygon.

                        b)   Cara Fisika

Kertas hasil pengembangan yang telah dikeringkan diamati dibawah sinar ultra violet pada panjang gelombang 254 atau 365 nm. RF nya dibandingkan terhadap bercak dari buku pembandingnya.

                        c)   Cara Biologis

Mendeteksi senyawa yang mempunyai aktifitas biologis tertentu misalnya : antibiotika. Cara ini lebih spesifik jika diperbandingkan terhadap cara fisika dan kimia. Bercak dari kromatogram diambil dan diletakkan dalam agar yang telah ditumbuhi dengan mikroorganisme tertentu, sesudah diinkubasikan dan diameter dari hambatan dapat menunjukkan kadar/potensi dari antibiotika

                        d)   Radioaktif

Senyawa yang mempunyai sifat radioaktif dideteksi dengan otoradiografi dengan suatu scaner yang akan mencatat dalam bentuk grafik puncak radioaktivitas yang menunjukkan letak dari senyawa yang diperiksa.

3.         KROMATOGRAFI LAPISAN TIPIS

Teknik kromatografi lapisan tipis (TLC) menggunakan suatu adsorben yang disalutkan pada suatu lempeng kaca sebagai fase stasionernya dan pengembangan kromatogram terjadi ketika fase lapisan tipis melewati adsorben itu. Seperti dikenal baik, kromatografi lapisan tipis mempunyai kelebihan yang nyata dibandingkan kromatografi kertas karena nyaman dan cepatnya, ketajaman pemisahan yang lebih besar dan kepekaannya yang tinggi. Uraian singkat mengenai prosedur eksperimental akan diberikan di sini dengan rujukan khusus ke pemisahan kation-kation.

Penyiapan lempeng. Dalam kromatografi lapisan tipis bahan penyalut yang beraneka macam, meskipun gel silika digunakan lebih sering daripada bahan lain. Namun pemisahan kation pada gel silika tak selalu memuaskan karena banyak kation mempunyai nilai RF yang hampir sama dan tetap terkelompok pada adsorben ini. Bubuk selulosa disarankan sebagai adsorben untuk pemisahan kation dengan TLC meskipun pemisahan mungkin lebih lambat dibandingkan dengan yang diperoleh dengan gel silika. Penggunaan bubuk selulosa dapat dianggap sebagai pengganti untuk kromatografi kertas anorganik dan data untuk kromatografi kertas umumnya dapat diterapkan pada TLC anorganik pada selulosa.

Lapisan-lapisan tipis selulosa dapat dibuat dengan menebarkan bubur bubuk Selulosa dalam air dengan mcnggunakan salah satu aplikator yang tersedia di pasar. Paling penting bahwa lempeng kaca yang akan diolesi lapisan tipis itu hendaknya bersih benar dan ini bisa dicapai dengan mencuci lempeng-lempeng itu dalam larutan natrium karbonat pekat yang disusul dengan membilas dengan air suling.

Bubur bubuk selulosa dalam air disiapkan dengan mencampurkan sekitar 15 gr bubuk dalam 90 cm³ air suling dan bubuk didispersikan selama sekitar 1 menit dengan menggunakan pengaduk (mixer) mekanis. Bubuk selulosa yang digunakan untuk TLC anorganik adalah dari macam mikrokristalin yang istimewa. Dalam kromatografi partisi, digunakan lempeng tak teraktifkan dari lapisan-lapisan selulosa dengan demikian tak memerlukan pengaktifan dengan pemanasan. Lempeng yang tersalut itu dapat dikeringkan selama semalaman pada temperatur kamar

Lapisan tipis yang siap pakai, yang disiapkan dengan adsorben yang paling meluas pemakaiannya, sekarang tersedia, yakni sebagai lempeng kaca dan lembaran plastik yang telah disalut. Lembaran plastik yang disalut dengan selulosa (yang dapat juga mengandung bahan pendaran) dipasarkan dan sangatlah memudahkan untuk pekerjaan TLC anorganik karena dapat dipotong-potong menurut ukuran yang diinginkan.

Apilkasi contoh. Larutan contoh yang akan diaplikasikan hendaknya berisi antara 0,1 dan 10 mg kation per cm³ dan dapat beasifat netral dari asam encer; sekitar ml larutan ditotolkan dengan sebuah spuit mikro (micro syringe) atau mikropipet di dekat salah satu ujung lempeng kromatografi (chromatoplate) (sekitar 1,5-2,0 cm dan pinggir lempeng) dan kemudian dibiarkan kering di udara.

Penyetimbangan lempeng kromatografi itu tidak perlu dari pengembangain lempeng itu dapat segera dimulai setelah dikeringkan.

Pengembangan lempeng. Biasanya kromatografi itu dikembangkan dengan teknik menaik dalam mana lempeng dicelupkan ke dalam pelarut pengembang (hendaknya digunakan pelarut taraf (kromatografi atau disuling ulang) sedalam 0,5 cm. Tanki atau bilik yang digunakan sebaiknya dilapisi lembaran kertas saring yang tercelup ke dalam pelarut dalam dasar bilik; ini memastikan penjenuhan bilik itu dengan uap pelarut (Gambar II).

                  

Gambar II

Pengembangan dibiarkan berlangsung sampai garis depan pelarut menjalani jarak yang diinginkan (biasanya 10-15 cm), lempeng itu kemudian diambil dari dalam bilik dan garis depan pelarut segera ditandai dengan garis pensil.

Posisi zat-zat terlarut yang telah terpisah dapat dilacak dengan pelbagai metode Zat-zat berwarna dapat dilihat langsung bila dipandang dengan fase stasioner sebagai latar belakang. Spesi tak berwarna biasanya dapat dideteksi dengan menyemprot lempeng itu dengan suatu reagensia yang tepat yang menghasilkan bercak berwarna dalam daerah-daerah spesi-spesi itu berada. Beberapa senyawa akan berpendar dalam cahaya ultraviolet dan dapat ditemukan tempatnya dengan cara demikian. Cara lain jika bahan berpendar dimasukkan dalam adsorben, maka zat terlarut dapat diamati. sebagai bercak gelap pada latar belakang berpendar bila diperiksa di bawah cahaya ultraviolet. (Bila mencari lokasi zona dengan metode ini mata hendaknya dilindung dengan mengenakan kacamata atau pelindung yang khusus). Bercak yang dicari tempatnya dengan metode ini dapat disketsa dengan menandainya dengan sebuah jarum.

Kromatografi lapisan tipis dengan menggunakan slaid mikroskop. Pemisahan kation dapat dicapai dengan sangat dimudahkan dengan menggunakan kaca mikroskop yang disalut selulosa (atau lembar selulosa yang diprasalut yang dipotong-potong sebesar kaca mikroskop). Bercak sangat kecil (diameter sekitar 1 mm dan larutan contoh ditaruh pada lempeng itu, misalnya, dengan menggunakan sepotong kertas yang diruncingkan yang dijenuhi dengan larutan itu. Lempeng dibiarkan kering di udara dan dikembangkan dalam sebuah botol kecil sampai garis depan pelarut bergerak 2-3 cm. Pemisahan dicapai dalam 5-10 menit dan kation-kation yang terpisah dapat ditentukan posisinya dengan prosedur yang biasa.

Kromatografi lapisan tipis anorganik kuantitatif. Analisis kuantitatif penyusun-penyusun yang telah dipisah pada lempeng lapisan tipis umumnya dilakukan dengan pengukuran rapatan (fotodensitas) dan luas bercak, yakni dengan fotodensitometri lempeng itu.

Prosedur macam ini meminta pembandingan bercak-bercak yang diperoleh dengan menggunakan campuran standar yang kuantitas-kuantitasnya diketahui, yang harus diuji secara kromatografi pada lempeng contoh itu juga.

Suatu prosedur lain melibatkan pengambilan komponen-komponen terpisah itu dari lempeng dengan mengorek bagian adsorben yang berkaitan dengannya. Komponen itu diekstrak (dielusi) dari dalam adsorben dengan pelarut yang cocok dan ditetapkan dengan menggunakan teknik fisika yang tepat, misalnya spektrofotometri ultraviolet, nampak atau fluoresensi.

3.1       HAL – HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN

a)                  Kromatografi lapis tipis seperti metode kromatografi lainnya adalah metode analisis pembanding. Untuk identifikasi senyawa haruslah digunakan senyawa pembanding dan tidak dapat digunakan RF yang ada dalam pustaka

b)                  Jika suatu sampel yang tidak diketahui memberikan suatu bercak setelah pengembangan dengan sistem pelarut tertentu. Belum berarti bahwa sampel mengandung hanya satu senyawa tersebut. Untuk memastikan harus dilakukan pengembangan dengan sistem pelarut yang lainnya atau digunakan pengembangan lainnya.

c)                  Jika suatu senyawa yang tidak diketahui menunjukkan harga RF yang sama dengan senyawa pembanding, belum berarti bahwa kedua zat adalah sama (identik). Untuk memastikan maka harus dikembangkan dengan pengembang yang lain.

4.         KROMATOGRAFI  CAIR KINERJA TINGGI (KCKT/HPLC)

            High Pressure Liquid Chromatography kadang-kadang disebut High Performance Liquid Chromatography. High performance hanya boleh jika ukuran partikel < 10 mm dan kolom dipack dengan baik. Di pack dengan baik artinya plate height kurang dari 5 meskipun perlu untuk meningkatkan sp 10 untuk beberapa aplikasi. KCKT tidak tergantung pada kemampuan sampel untuk menguap atau stabilitas sampel terhadap panas. Sangat berguna untuk pemisahan zat dengan bobot molekul tinggi ( makro molekul ) seperti protein, asam nukleat, polisakarida, pewarna, lipida, polimer sintetik, dll. Dapat digunakan lebih dari satu macam cairan sebagai cairan pembawa.

            HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

            HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

            Dengan HPLC dapat dilakukan pemisahan secepat kromatografi gas, dengan keuntungan zat-zat yang tidak menguap dan tidak stabil oleh panas dapat dipisahkan tanpa terjadi dekomposisi atau tanpa perlu menjadi derivat yang sudah menguap.

Alat HPLC secara skematis

            4.1       PRINSIP KERJA HPLC

            Pembagian HPLC berdasarkan sistim kerjanya ada 4 macam prinsip kerja, yaitu :

4.1.1    Kromatografi Adsorpsi

Mekanisme retensi dalam kromatografi adsorbsi adalah adanya interaksi antara gugus fungsional yang cukup polar dengan bagian partikel yang polar dan bersifat mengadsorpsi. Air memegang peranan penting dalam mekanisme ini, yang berfungsi rnengaktifkan permukaan gugus silanol, tetapi jumlah air yang berebihan akan cenderung menghilangkan keaktifan fase diam.

Fase diam yang digunakan adalah silika dan alumina. dimana gugus hidroksil pada permukaan silika dan alumina yang menyebabkan adsorpsi. Pada silika. gugus silanol bersifat asam, sehingga senyawa basa tertahan lebih lama dibanding senyawa netral/asam. Adsorban yang dipakai adalah bahan padat polar. sehingga urutan elusi mengikuti polaritas sampel. 

Fase gerak yang biasa digunakan dalam kromatografi adsorpsi adalah
fluoroalkana, n-pentana. karbon tetraklorida, xylen, toluen, benzen. Diklormetan, dioksan, tetrahidrofuran, asentoniltril, isopropanol dan metanol.

Aplikasi Kromatografi adsorpsi ini berdasar pada polaritas zat karena gugus hidroksil pada permukaan silika berinteraksi dan karena kekuatan intraksi tiap zat terlarut berbeda maka ada yang diadsorpsi lebih kuat dibandingkan dengan yang lainnya.

4.1.2    Kromatografi Partisi

Molekul zat terlarut mendistribusikan dirinya diantara dua fase cair yang tidak saling campur (fase gerak dan fase diam), sehingga harus mempunyai polaritas yang berbeda diantara dua fase tersebut. Fase diam harus merupakan pelarut yang baik bagi sampel, tetapi tidak baik bagi fase 2 gerak. Fase tetap melapisi fase penunjang secara uniform hingga kedua fase tak bercampur.

4.1.3    Kromatografi Pertukaran Ion

Kromatografi pertukaran ion terutama dimaksudkan untuk senyawa  yang mudah terionisasi seperti asam atau basa dan senyawa yang berinteraksi dengan gugus ionik. Secara sederhana mekanisme ektensi kromiatografi pertukaran ion dapat dijelaskan sebagai berikut :

Untuk pertukaran anion

X +  R⁺Y                                 Y  +  R⁺X

X = ion sampel, Y = ion fase gerak dan R = gugus bermuatan dari fase diam.
Ion sampel akan berkompetisi dengan ion fase gerak untuk berpasangan dengan penukar ion yang bermuatan positif

Untuk pertukaran kation

X ⁺ + R⁺Y^-                              Y⁺ + R^-X⁺

Kation sampel akan berkompetisi dengan ion fase gerak untuk berpasangan dengan penukaran ion yang bermuatan negatif.

Fase gerak yang biasa digunakan adalah larutan garam. seperti larutan dapar dan sejumlah tertentu pelarut organik yang  bercampur dengan air, misalnya metanol asetonitril dapat ditambahkan.

Kolom yang digunakan adalah berbagai jenis bahan penukar ion mulai dari gel halus yang cocok untuk pemisahan molekul besar seperti protein hingga gel keras yang hanya untuk pemisahan anorganik dan molekul kecil.

Aplikasinya misalnya untuk pemisahan bahan pengawet dalam makanan, pemisahan vitamin dan juga pemisahan golongan benzodiazepin

4.1.4    Kromatografi Ekslusi (gel)

Pada kromatografi ekslusi ini harus digunakan fase diam yang inver secara  kimia. Prinsip pemisahannya berdasarkan ukuran molekul larutan, menggunakan bahan pengisi kolom yang mempunyai ukuran pori-pori tertentu. Sampel dengan olekul pengisi kolom akan cepat terelusi dibandingkan dengan sampel yang ukuran molekulnya lebih kecil dari molekul pengisi kolom.

Fase gerak yang sering digunakan dalam kromatografi ekslusi adalah tetradirofuran, air dan untuk temperatur tinggi digunakan 1.2.4. triklosan, m-krem-kresol. Kolom yang digunakan dalam kromatografi ekslusi adalah silika polistiren, eter silika, reverse phase silika dan polistiren divinil benzen.

Aplikasinya untuk pemisahan sampel yang mempunyai bobot molekul tinggi, seperti senyawa polimer dan pemisahan vitamin A palmitat dari sedian vitamin. Kromatografi ekslusi yang dilakukan dalam sistem yang mengandung air sering disebut sebagai filtrasi gel, sedang jika dilakukan dalam sistem yang tidak mengandung air disebut permeasi gel.

                      

4.2              SISTEM KROMATOGRAFI CAIR

Jenis senyawa	Mode	Fese tetap	Fase gerak
Netral Asam lemah Basa lemah Ionik, Basa Asam Senyawa tidak larut dalam air, isomer organik Ion – ion Ion anorganik Senyawa dengan BM tinggi Polimer	Reversed Phase Ion pair ( Reversed phase ) Fase normal Penukar ion Size exclusion          ( SEC ) Pemisahan Chiral	C18, C8, C4, C-2, fenil TMS, Siano C18, C8 Silika, amino, siano, diol Penukar anion/kation, resin Polistirena Silika	Air / Modifier Organik Air / pereaksi Pasanganion organik Zat organik Larut dalam air/ dapar counter ion Gel Filtrasi : larut dalam air Gel Permeasi : pelarut organik

5.         KROMATOGRAFI GAS

Kromatografi Gas adalah teknik pemisah dari campuran zat yang menguap kedalam aliran gas pembawa yang mengalir, melewati kolam dan dipisahkan, hasil pemisahan keluar dari kolom untuk di evaluasi, dan dideteksi secara elektrik pada recorder. Waktu yang diperoleh dari masing-masing komponen yang timbul menunjukan waktu retensi dan hasil luas puncak yang dihasilkan sebanding dengan jumlah yang terkandung, adanya parameter ini kromatografi gas dapat menetapkan kualitatif dan kuantitatif.

            Kondisi contoh yang ideal pada pengujian secara kromatografi gas harus mudah menguap dan tidak  mengalami peruraian bentuk atau reaksi kimia, dan harus bergerak cepat kedalam kolom. Dalam kromatografi gas fase gerak adalah gas iner dan fase diam adalah zat padat atau zat cair yang diatur cukup padat didalam kolom

Kroamtografi gas padat atau gas “solid chromatography “bila fase diamnya berupa zat padat, sedangkan bila berupa lapisan tipis zat cair yang membungkus bahan penyangga yang iner maka disebut Kromatografi gas cair atau gas “liquid Chromatography”. Zat padat dalam kromatografi gas padat biasanya adalah : alumina, silica gel, charcoal atau ayakan molekuler dan serapan selektif pada zat padat diikuti pemisahan. Kromatografi gas cair lebih populer dan sangat penting, gas pembawa berjalan sambil membawa contoh melalui kolom dimana partisi contoh dalam gas dan cairan tetap.

*    Sistem kromatografi gas

Alat kromatografi gas terdiri dari beberapa bagian yang merupakan suatu rangkaian sistem yang masing-masing sangat menentukan didalam penggunaan alat, untuk melakukan pengujian suatu senyawa baik secara kualitatif dan kuantitatif.

Skema system kromatografi

                  

5.1             BAGIAN KROMATOGRAFI GAS

a)   Gas Pembawa

Gas yang biasa digunakan pada kromatografi gas yaitu : nitrogen, helium, argon dan hydrogen,

*    Syarat untuk gas pembawa :

1.   Iner, untuk mencegah interaksi dengan contoh atau pelarut contoh

2.      Murni dan mudah diperoleh

3.      Murah

4.      Koefesien difusi contoh pada gas tersebut rendah

5.      Cocok untuk detector yang digunakan

b)   Bahan penyangga padat

Penggunakan bahan penyangga bermaksud untuk memperoleh permukaan yang luas dan iner bagi lapisan fase diam.

*    Persyaratannya :

1.      Iner mempunyai interaksi kimia dan interaksi penyerapan dengan contoh yang minimal.

2.      Mempunyai permukaan yang luas ( 1 – 20 m²  tiap gram )

3.      Berukuran serba sama dan bentuknya teratur untuk memudahkan pengepakan, berpori dengan ukuran kira-kira 10 µm atau kurang.

Bahan baku untuk penyangga biasanya diatomae yang merupakan senyawa silikat dengan sedikit pengotoran dan osida logam. Didalam perdagangan dikenal dengan Chromosorb A,G,P,W dan T.

Chromosorb A  :  Digunakan untuk kromatografi Gas sekala preparative

Chromosorb G  :  Digunakan untuk memisahkan senyawa polar

Chromosorb  P :   Dibuat  dari  bata  merah,  merupakan  diatomae  yang

     dikalsinasi,   berwarna  merah.   Digunakan    terutama

     untuk hidrokarbon.

Chromosorb  W :  Warna putih, tidak menyerap, sangat cocok digunakan

      untuk pemisahan senyawa polar.

c)   Fase diam / Fase cair

Yang terpenting dalam kromatografi gas   cair  adalah  pemilihan  Fase  cair /    

fase diam yang tepat idealnya zat cair yang digunakan memenuhi persyaratan      

sebagai berikut :

1.              Pelarutan mutlak yang baik bagi komponen-komponen contoh jika kelarutan rendah komponen terelusi cepat dan pemisahan akan tidak sempurna

2.              Komponen-komponen contoh mempunyai koefisien partisi yang berbeda-beda

3.              Tidak menguap, tekanan 0,01 hingga 0,1 mm pada percobaan untuk sumur kolom yang cukup.

4.              Tahan panas, ketidak setabilan dapat disebabkan oleh efek bahan penyangga karena suhu dinaikan.

Yang sering digunakan : SE 30, OV, Carbowax

Fase cair dipilih tergantung dari komponen contoh, diharapkan tipe komponen yang ada didalam contoh kelak diketahui sebelum pengujian dilakukan. Dengan demikian akan memudahkan didalam pemilihan dan penyiapan kolom sesuai yang diperlukan. Didalam pemisahan yang normal, fase cair harus sesuai struktur kimianya dengan komponen didalam campuran, missal : senyawa hidrokarbon, senyawa polar pada pelarut polar, alkohol pada halkoamida.

Bila campuran komponen dari skala kimia yang berbeda, tetapi titik didih yang sama, maka harus digunakan fase cair dengan polaritas yang berbeda. Jumlah fase cair yang digunakan harus cukup untuk membentuk lapisan tipis yang serba sama pada partikel bahan penyangga. Effisiensi kolom dapat dipertinggi dengan menurunkan jumlah ini. Jenis bahan penyangga yang digunakan dari polaritas contoh menentukan konsentrasi fase cair pada bahan penyangga.

            d)   Kolom

Yang dimaksud kolom meliputi jenis kolom, isi kolom, yang terdiri dari fase cair dan bahan penyangga, bentuk kolom serta cara pembuatan kolom.

Ada dua macam jenis kolom yaitu  : “pecked kolom dan kapiler kolom “ sedangkan bentuk kolom bermacam-macam misalnya lurus, spiral, huruf U dan lain-lain.

Bahan gelas lebih disukai karena iner, panjang kolam biasanya 0,5 – 10 meter dengan diameter antara 3 – 1-  mm, sedangkan kapiler kolom panjang antara 10 – 50 meter, dengan diameter 0,1 – 1,2 mm, sedangkan fase diam dari kapiler kolom adalah berupa lapisan fase cair melekat pada dinding sebelah dalam dari kolom kapiler

                        e)   Detektor

                              Bagian pengindra dari senyawa-senyawa yang dipisahan dari kolom, ada dua                     macam detektor, detektor umum dan detektor selektif.

                              

                              Persyaratannya :

1.      Selektif

2.      Kepekaan

3.      Cukup responsif

4.      Tingkat derau (noise) rendah

5.      Tanggapan linearnya lebar

Macam-macam detector

1.      FID ( Flame Ionisation Detector )

FID Memberikan Respon hampir kepada setiap senyawa, kecuali udara, air dan gas mulia.

2.      ECD ( Electron Capture Detector )

ECD sangat selektif dan sensitive terhadap alkyl halide, karbinil yang terkonjugasi. nitril, nitrat. Selektifitas dan sensitifitasnya dari ECD membuat detector ini digunakan untuk pengujian residu pestisida, karena dapat mendeteksi dibawah subpoligram.

3.      TCD (Thermal Conductivity Detector )

Umumnya digunakan untuk analisa air dan senyawa anorganik

4.      MCD ( Micro Coulometric Detector )

Untuk analisa atom, N₂ O₂ ,S dan terutama halogen.

5.      FPD ( Flem Photometric Detector )

Untuk Analisa senyawa yang mengandung fosfor, sulfur

6.      Alkali Flame Detector

7.      Electrolytic Conductivity Detector

f)   Pengendalian Suhu

Untuk mengatur suhu oven dari tempat penyuntikan, kolom dan detector.  Pada pengujian dengan kromatografi gas pengaturan suhu tersebut biasanya sudah dicantumkan dalam pustaka, sehingga hanya dicari parameter yang lain mengingat sifat dari alat berbeda, baik merek dan tipe yang sama. Suhu tempat penyuntikan, kolom dan detector selama pengujian dengan alat kromatografi gas berlangsung harus tetap.

                        g)   Amplifier

                              Alat untuk memperbesar respon yang berasal dari detektor

h)   Rekorder / Perekam

Digunakan untuk merekam hasil dari deteksi yang diberikan oleh detector, hasil rekaman ini berupa gambar kromatogram, dan ada yang sudah menggunakan unit prosesing komputer

                        i)   Analisa Kualitatif

     Parameter  yang  paling  penting  untuk  mengidetifikasi  salah   satu   puncak   

     adalah waktu retensi. Harus dibandingkan terhadap waktu retensi standart

                        j)   Analisa Kuantitatif

                       Cara perhitungan

1.      Normalisasi luas

      Dengan menghitung luas masing-masing puncak,kemudian dijumlahkan prosentase luas puncak adalah : luas puncak dibagi dengan jumlah luas puncak keseluruhan dikalikan 100 %. Ini dapat dilakukan dengan anggapan bahwa keseluruhan puncak dapat dipisahkan

2.      Menggunakan Faktor koreksi

3.      Menggunakan tinggi puncak

      Jika puncak pada kromatogram sangat sempit, maka hanya diukur tinnginya saja, yaitu jarak dari dasar hingga puncak maksimum

4.      Tinggi puncak kaki lebar setengah tinggi

5.      Luas segitiga

6.      Memotong dan menimbang kertas

7.      Menggunakan digital integrator

            5.2       KESALAHAN-KESALAHAN YANG SERING TERJADI

                       

a)      Sampling pada pemilihan contoh dan atau terjadi kontaminasi

b)      Pembuatan larutan uji

c)      Kromatografi dalam teknik injeksinya

d)     Integrasi dan  perhitungan hasil

            5.3       FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI HASIL

                       

a)      Laju gerak / aliran fase gerak

b)      Suhu

DAFTAR  PUSTAKA

1. Farmakope Indonesia Edisi IV tahun 1995, DEPKES Republik Indonesia
2. Buku Ajar VOGEL Edisi IV, oleh J. Basset, M.Sc, C. Chem., F.R.I.C. dkk
3. Situs Web Kimia Indonesia : www.chem-is-try.org
4. Instrument Laboratorium Kesehatan Penerbit DEPKES (PUSDIKNAKES) 1995